Yêu cầu xét nghiệm bộ dụng cụ ELISA

Thực hiện tương phản tốt trong thử nghiệm chính thức, nên lấy các điều kiện thử nghiệm đối chứng dương và âm, và các mẫu cần thử phải được làm thành hai bản để đảm bảo tính chính xác của kết quả thử nghiệm.

Đôi khi nồng độ nền cao hơn chứng tỏ phản ứng không đặc hiệu, có thể đóng lại bằng huyết thanh cừu, huyết thanh thỏ hoặc BSA.

Lựa chọn điều kiện thí nghiệm

Trong ELISA, điều quan trọng là phải chọn các điều kiện thí nghiệm khác nhau, bao gồm: (1) Lựa chọn chất mang pha rắn: Nhiều chất có thể được sử dụng làm chất mang pha rắn, chẳng hạn như PVC, polystyrene, polyacrylamide và cellulose. Nó có thể ở dạng tấm lõm, ống nghiệm, hạt, v.v. Hiện nay, người ta thường sử dụng tấm lõm polystyrene 40 giếng.

Bất kể loại chất mang nào, trước khi sử dụng đều có thể được sàng lọc: với cùng một lượng gói kháng nguyên, trong cùng điều kiện thí nghiệm để phản ứng, để quan sát xem phản ứng tạo màu của nó có đồng nhất hay không, theo đó hiệu suất hấp phụ tốt. (2) Đóng gói theo lựa chọn kháng thể (hoặc kháng nguyên): kháng thể (hoặc kháng nguyên) được hấp phụ trên bề mặt chất mang pha rắn-, mức độ nghiêm trọng yêu cầu cao hơn, sự hấp phụ thường yêu cầu PH từ 9,0 đến 9,6. Nhiệt độ hấp phụ, thời gian và lượng protein cũng có tác động nhất định, thường là trên 4 độ C trong 18 đến 24 giờ. Nồng độ tối ưu của gói protein cần phải được chuẩn độ: sau khi được đóng gói với các nồng độ protein khác nhau (0,1, 1,0 và 10 µg/ml, v.v.), giá trị OD của mẫu dương tính được quan sát thấy khi các điều kiện thử nghiệm khác giống nhau. Chọn nồng độ có giá trị OD lớn nhất và lượng protein thấp nhất.

Đối với hầu hết các protein, nó thường là từ 1 đến 10 µg/ml. (3) Lựa chọn nồng độ làm việc của kháng thể được đánh dấu-theo enzyme: đầu tiên, hiệu quả ban đầu của việc chuẩn độ bằng phương pháp ELISA trực tiếp (xem phần kháng thể được đánh dấu-theo enzyme).

Sau đó, khắc phục các điều kiện khác hoặc thực hiện "phương pháp mảng vuông" (đóng gói sắc nét, tham chiếu cho mẫu cần kiểm tra và các kháng thể được gắn nhãn-enzim là các độ pha loãng khác nhau) trong hệ thống thí nghiệm chính thức để chuẩn độ chính xác nồng độ làm việc của nó. (4) Sự lựa chọn bazơ của enzyme và chất cho hydro: việc lựa chọn chất cho hydro không tốn kém, an toàn, có phản ứng tạo màu rõ ràng-và bản thân nó không màu. Một số chất cho hydro (ví dụ OPD, v.v.) có khả năng gây ung thư, cần thận trọng để bảo vệ. Những người có điều kiện nên sử dụng các chất cho hydro không gây ung thư, có độ nhạy cao, chẳng hạn như TMB và ABTS hiện là những chất cho hydro hài lòng hơn. Sau một thời gian tác dụng, cần thêm axit mạnh hoặc kiềm để dừng phản ứng. Thông thường thời gian tác dụng của lớp nền khoảng 10-30 phút là phù hợp. Chất lỏng sử dụng chất nền phải được chuẩn bị mới, đặc biệt nếu H2O2 được thêm vào trước khi sử dụng.